Nghiên cứu

Hồ Huỳnh Thùy Dương - Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh


 

Tóm tắt

            Các phương pháp sinh học phân tử được ứng dụng vào việc xây dựng chẩn đoán phân tử thuộc hai nhóm, nhóm nhân bản DNA, RNA (PCR, real-time PCR, NASBA, …) và nhóm không nhân bản DNA, RNA (bDNA, hybrid capture, ..). Chẩn đoán  phân tử trong lĩnh vực bệnh nhiễm thường được sử dụng để sàng lọc nhanh, phát hiện, định type, định lượng, xác định tính kháng thuốc của các tác nhân bệnh, chủ yếu là virus và vi khuẩn. Bên cạnh ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu, phát hiệm sớm, thời gian xét nghiệm nhanh, chẩn đoán phân tử vẫn có một số nhược điểm như khả năng cho kết quả dương tính và âm tính giả, ý nghĩa lâm sàng của kết quả chẩn đoán trong một số trường hợp không rõ ràng, thiếu tính thống nhất trong kết quả thu được từ các kit khác nhau, cần thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên lành nghề. Trong tương lai, một số khái niệm như : phát hiện các yếu tố di truyền ở người bệnh, “xét nghiệm tại chỗ” (Point-of-Care Testing), các công cụ chẩn đoán mạnh, rẻ tiền sẽ được phát triển để biến chẩn đoán phân tử thành một bộ phận thiết yếu trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Chẩn đoán phân tử cần được xác nhận tính hiệu quả (validation) một cách nghiêm ngặt để có thể áp dụng rộng rãi.

 

            Sự phát triển của công nghệ sinh học, trên nền tảng của sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp phân tử có ý nghĩa ứng dụng lớn trong y học phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị. Trong lĩnh vực chẩn đoán, việc tích lũy ngày càng nhiều và nhanh thông tin về bộ gene người và các tác nhân gây bệnh, kể từ khi Chương trình Bộ Gene Người (Human Genome Project) cơ bản hoàn tất, là đóng góp thiết yếu thứ hai dẫn đến sự hình thành chẩn đoán phân tử. Bên cạnh đó, mối liên kết ngày càng chặt chẽ giữa các trường đại học, viện nghiên cứu với các bệnh viện và cơ sở y tế đã tạo thuận lợi cho việc triển khai các chẩn đoán phân tử vào thực tiễn. Một yếu tố đặc biệt quan trọng cho sự “phổ thông hóa” chẩn đoán phân tử là đóng góp của các công ty công nghệ sinh học vào việc chế tạo và thương mại hóa nhiều trang thiết bị y tế hiện đại cùng với các “kit” (tạm dịch là “bộ thuốc thử”) dùng trong chẩn đoán. Đến thời điểm hiện nay, Cơ quan Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng vào chẩn đoán tại Hoa Kỳ 59 kit cho vi khuẩn, nấm, ký sinh và 61 kit cho virus.21

 

CHẨN ĐOÁN Y HỌC BỆNH NHIỄM VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ THÔNG DỤNG

        Chẩn đoán y học ở Phương Tây được ghi nhận kể từ Imhotep (2655-2600 TCN), nhà kiến trúc, chế tạo công cụ và y học tài ba của Ai câp cổ đại và Hippocrates (~460-370 TCN), Cha đẻ của y học hiện đại. Ở Phương Đông, chẩn đoán được xem như bắt nguồn từ thời Hoàng Đế (2697- 2599 TCN). Đến nay, dù đã tiến bộ vượt bậc, chẩn đoán y học về cơ bản vẫn là sự phân loại – phân loại và định danh bệnh – dựa trên một số đặc điểm. Nếu trước đây, những đặc điểm đó chủ yếu mang tính lâm sàng và dựa trên thông tin do người bệnh cung cấp thì bây giờ những đặc điểm cận lâm sàng như chỉ tiêu sinh hóa, huyết học, miễn dịch, và phân tử ngày càng bổ sung hiệu quả cho công tác chẩn đoán.

 

Những phương pháp sinh học phân tử sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong chẩn đoán bệnh nhiễm đều nhằm phát hiện một số đặc điểm cũa vật liệu di truyền (DNA, RNA) ở tác nhân bệnh, và có thể được xếp vào hai nhóm, chủ yếu khác nhau ở chỗ có hay không có bước nhân bản một hoặc nhiều trình tự gene của tác nhân bệnh. Nhóm các phương pháp phát hiện không thông qua nhân bản bao gồm bDNA (branched DNA), Hybrid capture, FISH (Fluorescent in situ Hybridization), .... Nhóm các phương pháp nhân bản thông dụng nhất là PCR (Polymerase Chain Reaction) (nhân bản DNA từ vi khuẩn, nấm, ký sinh), RT-PCR (nhân bản RNA từ một số virus), real-time PCR. Ngoài ra còn có một số phương pháp khác dựa trên nguyên lý nhân bản đẳng nhiệt như SDA (Strand Displacement Amplification) nhân bản DNA, hoặc NASBA nhân bản DNA/RNA.8, 13

 

Phương pháp bDNA

Mỗi trình tự gene mục tiêu hiện diện trong mẫu được nhận biết và bắt cặp bởi nhiều trình tự mẫu dò sơ cấp ; bản thân từng trình tự mẫu dò sơ cấp lại bắt cặp với nhiều trình tự mẫu dò thứ cấp hình thành một cấu trúc cây với nhiều nhánh chính, phụ. Mỗi trình tự mẫu dò thứ cấp đến lượt chúng lại gắn nhiều phân tử enzyme alkaline phosphatase (AP). Khi cho cơ chất của AP vào phản ứng, cơ chất bị AP biến đổi thành sản phẩm phát quang. Như vậy một trình tự mục tiêu sẽ tương ứng với một số lượng lớn tín hiệu phát quang do các phân tử AP tạo ra. Chính sự nhân bản tín hiệu ở đây đã làm tăng độ nhạy của phản ứng, cho phép phát hiện một lượng nhỏ vật liệu di truyền của tác nhân bệnh. Kit VERSANT HCV RNA 3.0 Assay (bDNA) (Bayer) dùng để định lượng virus viêm gan C (HCV) là một ví dụ cho phương pháp này.

 

Phương pháp Hybrid capture

            Kit digene HC2 HPV DNA test (Qiagen) phát hiện 13 type “nguy cơ cao” và 5 type nguy cơ thấp của Human Papillomavirus (HPV) minh họa cho nguyên lý này. Trước tiên, một trình tự DNA mục tiêu trên bộ gene của HPV tách chiết từ bệnh phẩm được biến tính và lai phân tử với mẫu dò (probe) RNA tương ứng trong dung dịch. Các phân tử lai DNA-RNA sẽ được bắt giữ bởi một kháng thể cố định trên một bề mặt rắn. Tiếp đó, một cộng hợp bao gồm kháng thể nhận biết và gắn phân tử lai cùng với enzyme alkaline phosphatase (AP) được thêm vào. Cuối cùng, khi cơ chất được cho vào, phản ứng sẽ bị thành phần AP của cộng hợp thủy phân tạo sản phẩm phát sáng. Tín hiệu hóa quang được thiết bị ghi nhận và xử lý để cho kết quả.

 

Phương pháp PCR

Đây là phản ứng tổng hợp phân tử DNA bằng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (như Taq polymerase). Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại. Mỗi chu kỳ gồm ba bước trong đó phân tử mạch đôi DNA ban đầu được biến tính ở bước gia nhiệt, trở thành khuôn để tạo hai phân tử mới ở các bước lai và kéo dài mạch tiếp đó. Đến lượt chúng, các phân tử mới hình thành lại được biến tính và sự tổng hợp tiếp tục cho đến khi số lượng phân tử DNA trong phản ứng đạt mức có thể phát hiện được bằng một phương pháp thông dụng như điện di hay ELISA. Các “biến thể” từ phương pháp PCR rất đa dạng như AS (Allele-specific) PCR phát hiện đột biến điểm, multiplex PCR phát hiện đồng thời nhiều trình tự gene, nested/semi-nested PCR làm tăng tính đặc hiệu và độ nhạy của PCR truyền thống, MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification)  phát hiện cùng lúc nhiều đột biến điểm, RT-PCR (Reverse Transcription PCR) phát hiện vật liệu di truyền là RNA, ...

Các ứng dụng của PCR cũng như của các phương pháp “biến thể” rất rộng bao trùm nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng trong y sinh học. Trong chẩn đoán bệnh nhiễm, đây là phương pháp cơ bản không thể thiếu cho các ứng dụng về tạo dòng và giải trình tự bộ gene, phát hiện vật liệu di truyền, xác định kiểu gene và một số đặc điểm như tính kháng thuốc, khả năng gây độc, ... của tác nhân bệnh.

Trong số các biến thể của PCR, real-time PCR có một vai trò đặc biệt và ngày càng phổ biến. Phương pháp này tuân thủ nguyên lý tổng hợp DNA của PCR kết hợp với việc sử dụng các phân tử phát huỳnh quang. Các tác nhân phát huỳnh quang thuộc hai nhóm - nhóm gắn vào DNA mạch đôi (DNA binding dye) và nhóm dùng để đánh dấu mẫu dò đặc hiệu. Nhóm thứ nhất có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi phí đầu tư thấp ; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm nhân bản không cao nên phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc. Nhóm thứ hai được thiết kế riêng cho từng trình tự DNA mục tiêu nên có tính đặc hiệu cao hơn nhưng chi phí đầu tư cũng cao hơn và tốn công sức hơn.

Nhóm gắn vào DNA mạch đôi như SYBR Green I chỉ phát huỳnh quang khi ở dạng liên kết với DNA. Trong phản ứng, khi có sự nhân bản của trình tự DNA đích thì các phân tử SYBR Green I sẽ liên kết với các sản phẩm DNA mạch đôi vừa được tạo mới và bắt đầu phát tín hiệu huỳnh quang. Lượng trình tự mới tạo ra càng nhiều, tín hiệu huỳnh quang phát ra càng mạnh.

Nhóm thứ hai dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu gồm nhiều tác nhân đa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, …, được sử dụng với nhiều loại mẫu dò như mẫu dò lai (hybridization probe), mẫu dò thủy giải (hydrolysis probe), mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) như “molecular beacon”. Trong số này, phổ biến nhất là mẫu dò thủy giải với tên gọi là Taqman probe.

Real-time PCR sử dụng TaqMan probe dựa trên hai hoạt tính ngược nhau của Taq polymerase, hoạt tính tổng hợp DNA và hoạt tính thủy giải. Bên cạnh các “mồi” (primer) của PCR truyền thống, người ta còn sử dụng thêm mẫu dò (Taqman probe) là một đoạn DNA ngắn có thể bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu ở một vị trí nằm giữa hai “mồi”. Mẫu dò được đánh dấu một đầu bằng nhóm phát huỳnh quang (reporter dye), và đầu kia bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye). Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn. Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính thủy giải của Taq polymerase cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò khiến nó không còn chịu tác động của nhóm “dập” và sẽ phát tín hiệu huỳnh quang. Như vậy, cường độ huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với lượng sản phẩm đích được nhân bản trong phản ứng.

        Định lượng DNA là ứng dụng mạnh nhất của phương pháp này. Real-time PCR thường được ứng dụng để đồng thời phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm, ... phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi điều trị. “Chu kỳ ngưỡng” (cycle threshold – Ct) là khái niệm cơ bản trong real-time PCR định lượng. Trong phản ứng PCR, đó là chu kỳ mà ở đó tín hiệu huỳnh quang do sự nhân bản đặc hiệu trình tự DNA mục tiêu bắt đầu vượt khỏi tín hiệu nền. Số lượng trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu càng cao thì số chu kỳ cần để tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền càng thấp, nghĩa là giá trị Ct càng thấp. Để định lượng một trình tự DNA mục tiêu, người ta xây dựng một đường chuẩn với một dãy nồng độ của một trình tự DNA chứng đã biết cùng với các giá trị Ct tương ứng. Giá trị Ct của mẫu nhận được từ phản ứng real-time PCR sẽ được áp vào đường chuẩn, từ đó suy ra được lượng trình tự mục tiêu có trong mẫu ban đầu.8

            Nhiều bộ kit thương mại hóa sử dụng Taqman probe như COBAS Taqman HBV Test (Roche Molecular Diagnostics) hay Abbott Real-time HBV (Abbott Molecular).

 

Các phương pháp nhân bản RNA qua trung gian phản ứng phiên mã

Một số phương pháp được sử dụng đặc biệt để nhân bản RNA như NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) hay TMA (Transcription-Mediated Amplification) tuy vẫn có thể được cải biên để nhân bản DNA. Đặc điểm của các phương pháp này là phản ứng được tiến hành ở điều kiện đẳng nhiệt (41°C-42°C).

Hai phương pháp này nhân bản trình tự mục tiêu là RNA thành nhiều bản sao mới qua nhiều bước. Trước tiên RNA được phiên mã ngược thành cDNA. Sau đó mỗi phân tử cDNA sẽ được phiên mã (xuôi) thành nhiều phân tử RNA mới. Đến lượt chúng, các RNA mới lại được phiên mã ngược thành nhiều phân tử cDNA mới và chu kỳ lặp đi lặp lại nhiều lần. Các phương pháp này có ưu điểm là không cần thiết bị gia nhiệt và thường có độ nhạy rất cao. Chúng được ứng dụng để phát hiện RNA virus hoặc vi khuẩn sống.8

Nhìn chung, mặc dù độ nhạy của các phương pháp nhân bản, như PCR, real-time PCR,  NASBA, TMA, ... cao hơn so với các phương pháp không nhân bản nhưng chúng không phải lúc nào cũng là lựa chọn ưu tiên vì cả hai nhóm đều có những ưu và nhược điểm riêng. Việc chọn lựa phương pháp sử dụng cho chẩn đoán đối với từng bệnh còn phụ thuộc vào ý nghĩa lâm sàng trong tiên lượng, điều trị và theo dõi điều trị bệnh đó, nghĩa là cần dựa trên nhiều công trình nghiên cứu trên đối tượng (bệnh nhân và tác nhân gây bệnh) cụ thể. Những tiêu chí khác cần quan tâm là chi phí chẩn đoán, phương tiện về nhân lực và vật lực, các yếu tố văn hóa xã hội, ... 13

 

ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

         Tuy chẩn đoán phân tử có nhiều ưu điểm như độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian xét nghiệm ngắn nhưng chúng không thể thay thế hoàn toàn các phương pháp chẩn đoán truyền thống trong mọi trường hợp.

 

Vậy vai trò thực sự của các chẩn đoán phân tử là gì ?

 

Chẩn đoán phân tử đối với các bệnh do virus

Trong các nhóm tác nhân liên quan đến bệnh nhiễm ở người thì virus là đối tượng được quan tâm nhiều nhất trong việc phát triển các chẩn đoán phân tử. Lý do chính là vì các biện pháp chẩn đoán truyền thống có nhiều bất lợi – nuôi cấy đòi hỏi kỹ thuật viên lành nghề, tốn thời gian và tiền bạc mà độ nhạy lại thấp do nhiều virus mọc khó hoặc không mọc trên môi trường nhân tạo. Chẩn đoán huyết thanh học cũng không thật hữu dụng : (1) không phát hiện được kháng nguyên do hàm lượng qua thấp trong cơ thể bệnh nhân, (2) không phát hiện được kháng thể trong giai đoạn nhiễm sớm khi cơ thể người bệnh chưa tạo kháng thể hoặc trong trường hợp suy giảm miễn dịch do bệnh hay do thuốc, (3) việc tạo kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu cho chẩn đoán tốn rất nhiều công sức, tiền bạc và thời gian nên số lượng sử dụng thực tế không đáp ứng đủ nhu cầu.17

Sàng lọc nhanh để đối phó dịch

Những đợt dịch hô hấp gần đây do các virus như coronavirus gây SARS hay virus cúm A/H5N1 cho thấy vai trò quan trọng của những chẩn đoán phân tử nhanh như PCR trong việc loại trừ những trường hợp không phải SARS, xác định nhanh và sớm các trường hợp SARS để kịp thời cách ly hạn chế lây nhiễm. Việc sử dụng PCR xác định chính xác tác nhân bệnh giúp hạn chế số bệnh nhân nhập viện, giảm các xét nghiệm không cần thiết, chọn phương pháp điều trị phù hợp, hạn chế việc dùng kháng sinh không hợp lý. Dịch cúm gia cầm vừa qua cũng cho thấy tính cấp thiết của việc xây dựng những phương pháp chẩn đoán nhanh.11, 14

Tiên lượng, quyết định điều trị và theo dõi điều trị thông qua việc định lượng và định kiểu gene (genotype)

Trong trường hợp nhiều bệnh truyền qua đường máu như AIDS, viêm gan siêu vi B, C, các chẩn đoán phân tử có vai trò quan trọng cả trong việc phát hiện lẫn trong theo dõi điều trị. Phát hiện RNA của HCV (Hepatitis C Virus) và HIV (Human Immunodeficiency Virus), DNA của HBV (Hepatitis B Virus) trong giai đoạn “cửa sổ” khi cơ thể người bị nhiễm chưa kịp tạo kháng thể rất cần cho công tác truyền máu. Việc xác định kiểu gene của HCV trong viêm gan siêu vi C mãn tính cần cho tiên lượng cũng như quyết định điều trị. Nhiễm HCV kiểu gene (genotype) 2, 3 cần điều trị 6 tháng với tỉ lệ thành công khoảng 76% trong khi nhiễm kiểu gene 1 có tỉ lệ thành công chỉ 56 % dù phải điều trị 12 tháng.4 Việc sử dụng liệu pháp đơn lamivudine cho viêm gan siêu vi B mãn tính làm xuất hiện tình trạng kháng thuốc với tỉ lệ tăng dần theo thời gian điều trị.2 Sự hiện diện của các đột biến trên vùng pre-core của bộ gene HBV làm mất “chỉ thị” (marker) HBeAg khi chẩn đoán huyết thanh mặc dù bệnh vẫn ở giai đoạn hoạt động. Xác định kiểu gene HCV, tính kháng lamivudine của HBV và phát hiện đột biến pre-core là những vấn đề trên cho đến nay chỉ có thể giải quyết bằng chẩn đoán phân tử.

Hàm lượng virus trong huyết thanh là tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả điều trị. Nếu hàm lượng RNA HCV kiểu gene 1 xuống dưới ngưỡng phát hiện sau 12 tuần điều trị thì có 75% cơ may bệnh nhân có đáp ứng siêu vi kéo dài (sustained virological response).4 Trong trường hợp viêm gan siêu vi B, sự tăng hàm lượng HBV báo hiệu sự xuất hiện các thể kháng lamivudine. Các phương pháp phân tử như real-time PCR, bDNA là cơ sở cho các định lượng vừa kể. 20

 

Chẩn đoán phân tử đối với các bệnh do vi khuẩn

         Phát hiện nhanh vi khuẩn khó hoặc không thể nuôi cấy

        Nhiều vi khuẩn có tác động tiêu cực đối với sức khỏe cộng đồng như Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoea, đều thuộc nhóm khó nuôi cấy.13 Thay vì phải chờ nhiều tuần thì việc sử dụng phương pháp PCR  có thể cho kết quả trong thời gian có thể tính bằng giờ trên bệnh phẩm nghi nhiễm M. tuberculosis. Một số vi khuẩn khó nuôi cấy có khả năng gây dịch như Legionella spp., Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae, .. cũng là đối tượng của nhiều chẩn đoán phân tử nhanh, chủ yếu dựa trên PCR. Can thiệp lâm sàng kịp thời dựa trên việc phát hiện nhanh và đồng thời những vi khuẩn khó nuôi cấy và là tác nhân chính gây viêm màng não như Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniaeHaemophilus inflluenzae đã được thực hiện bằng PCR multiplex.20

Xác định tính kháng thuốc

Việc nhận diện Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) hiện nay được tiến hành thông qua việc phát hiện gene mecA bằng phương pháp PCR.15 Các phương pháp phân tử như PCR, real-time PCR, giải trình tự trên các gene rpoB, hsp65, gyrA, inhA, ... cho phép phát hiện M. tuberculosis kháng và đa kháng thuốc.6

Một ích lợi đặc biệt của chẩn đoán phân tử là chúng có thể được thực hiện từ mẫu bệnh không cần được bảo quản để giữ cho vi sinh vật sống sót, ví dụ những bệnh phẩm để khô hoàn toàn có thể dùng cho phản ứng PCR vì DNA hầu như không bị phân giải. Điều này có ý nghĩa cho những vùng xa, kém phát triển khi phải vận chuyển bệnh phẩm đi xa. Ngoài ra, điều này còn phù hợp cho xu hướng thu mẫu bệnh do người bệnh tự thực hiện ở nhà và gửi đến cơ sở xét nghiệm.17

         Vai trò của chẩn đoán phân tử trong các trường hợp nhiễm nấm, ký sinh trùng, ... không được nổi bật như ở virus và vi khuẩn mặc dù cũng có một số ví dụ về lợi ích của phương pháp PCR trong phát hiện ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum) hiện diện với hàm lượng thấp không quan sát thấy dưới kính hiển vi cũng như xác định tính kháng thuốc của nó.17

         Bên cạnh đóng góp tích cực trong lĩnh vực sức khỏe cộng đồng thông qua việc can thiệp vào các đợt dịch bệnh trên toàn cầu, chẩn đoán phân tử còn được sử dụng nhiều trong an toàn sinh học khi các nguy cơ về vũ khí sinh học do Bacillus anthracis, virus đậu mùa, Yersinia pestis, ... không còn là vấn đề khó tưởng tượng.17

 

         Những giới hạn của chẩn đoán phân tử là gì ?

         Nuôi cấy và định danh vi sinh truyền thống cho phép phát hiện tất cả các loài vi khuẩn mọc được trên môi trường sử dụng. Trong khi đó, mỗi phản ứng PCR chỉ phát hiện được một hoặc vài loài xác định, trừ PCR “phổ rộng” (broad-range PCR). Bên cạnh đó, những phương pháp truyền thống như nuôi cấy, sinh hóa, miễn dịch cũng không ngừng được cải tiến cho đến nay để làm tăng hiệu quả và tính tiện lợi, giảm giá thành và thời gian xét nghiệm, một số còn được tự động hóa. Trong những trường hợp như vậy, việc áp dụng chẩn đoán phân tử là không cần thiết. Bên cạnh các nhược điểm như giá cao, đòi hỏi thiết bị hiện đại đắt tiền và kỹ thuật viên lành nghề, chẩn đoán phân tử còn một số nhược điểm khác.13

 

Kết quả âm tính và dương tính giả

Âm tính giả và dương tính giả là hạn chế rõ nhất của chẩn đoán phân tử.

Dương tính giả là hạn chế gắn liền với các phương pháp nhân bản gene, nhất là PCR. Với độ nhạy cao, PCR sẽ nhân bản một lượng rất nhỏ trình tự DNA mục tiêu còn tồn tại ngoài ý muốn trong môi trường làm việc từ những lần nhân bản trước mặc dù trong mẫu hoàn toàn không có trình tự ấy. Nhiều biện pháp loại ngoại nhiễm như phân chia khu vực thao tác, chiếu tia tử ngoại môi trường làm việc, sử dụng các dụng cụ xài một lần và chống nhiễm chéo, sử dụng dUTP kết hợp với Uracyl N-glycosylase (UNG), ..... Kỹ thuật viên lành nghề là yếu tố quyết định. Và các chứng âm, có chứa mọi thành phần của phản ứng PCR trừ DNA tách chiết từ mẫu, phải luôn luôn được sử dụng cho mỗi lô phản ứng PCR. Kết quả âm tính trên chứng âm là đảm bảo lô phản ứng không bị ngoại nhiễm

Với độ nhạy cao hơn hẳn các phương pháp chẩn đoán truyền thống, âm tính giả dường như là một nghịch lý khi nói về chẩn đoán phân tử. Thực ra, tình trạng âm tính giả xuất hiện phần lớn do đặc điềm của mẫu. Một số mycobacteria có vách dày khó phá hủy để giải phóng DNA mục tiêu. Mẫu phân, đờm có thể chứa enzyme phân hủy DNA và RNA. Một số chất có trong mẫu ban đầu như EDTA, heparin (chống đông máu), huyết sắc tố, polysaccharides, một số thuốc, ... hoặc được dùng cho quá trình tách chiết DNA từ mẫu như phenol, isopropanol, .. có khả năng ức chế nhiều phản ứng enzyme, trong đó có PCR dẫn đến tình trạng âm tính giả. Do đó, bước tách chiết DNA, RNA từ mẫu cần được tiến hành theo phương pháp phù hợp cho từng loại mẫu. Điều quan trọng là mỗi phản ứng PCR trên một trình tự mục tiêu luôn phải được tiến hành song song với một chứng nội (internal control). Chứng nội là một trình tự gene luôn luôn tồn tại trong mẫu một cách tự nhiên, ví dụ như gene b-globin ở người, hoặc được cố ý thêm vào phản ứng. Kết quả dương tính trên chứng nội cho thấy phản ứng PCR không bị ức chế.8, 17

 

Ý nghĩa lâm sàng của chẩn đoán

        Trong viêm màng não xâm lấn do N. meningitidis chẳng hạn thì việc phát hiện DNA mục tiêu trong mẫu có giá trị tiên đoán dương rất cao.  Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khác, một lượng tác nhân bệnh dưới ngưỡng gây bệnh tuy có thể được phát hiện bằng chẩn đoán phân tử có độ nhạy cao cũng sẽ không có ý nghĩa lâm sàng. Tương tự, trong trường hợp bệnh nhân dùng kháng sinh trước khi xét nghiệm, DNA phát hiện được là của vi khuẩn đã chết không còn khả năng gây bệnh. Để giải quyết vấn đề này, người ta có thể sử dụng các phương pháp phát hiện RNA thay vì DNA vì RNA sẽ bị phân hủy nhanh hơn DNA rất nhiều sau khi tế bào chết nên kết quả dương tính tương ứng với vi khuẩn còn sống.8, 17

 

Sự thiếu đồng nhất trong kết quả chẩn đoán phân tử

        Sự tồn tại của nhiều quy trình chẩn đoán tiến hành ở nhiều cơ sở y tế, phòng xét nghiệm khác nhau dẫn đến tình trạng thiếu tính thống nhất, gây khó khăn cho việc so sánh kết quả giữa các đơn vị khác nhau. Ngay cả đối với các xét nghiệm đã được thương mại hóa cũng có sự không thống nhất trong kết quả giữa các kit khác nhau.1

 

MỘT SỐ TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

            Về đối tượng của chẩn đoán phân tử, bên cạnh các tính chất của tác nhân gây bệnh người ta ngày càng hướng tới việc tìm hiểu các đặc tính di truyền của người bệnh có liên quan đến diễn tiến bệnh, ví dụ tính mẫn cảm đối với một tác nhân bệnh xác định, khả năng đáp ứng đối với thuốc, .. Nhiều công bố gần đây cho thấy, ở người bệnh bị nhiễm HCV genotype 2 và 3, có ba vị trí đột biến đa hình gần gene IL28B của người bệnh (có tên là rs8099917, rs12980275 và rs12979860) có liên quan chặt chẽ đến đáp ứng của người bệnh đối với liệu pháp interferon a/ribavirin.16 Một đột biến đa hình nằm trên vai ngắn của nhiễm sắc thể 6 ở người được xem là nhân tố nguy cơ cho diễn tiến ung thư gan khi bị nhiễm HCV.7 Trong bệnh lao, một số đặc tính di truyền của người bệnh ví dụ các đột biến đa hình ở gene SLCI IAI ảnh hưởng đến sự mẫn cảm của người bệnh đối với M. tuberculosis.10 Một số đột biến đa hình trên gene IL-1b làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày khi bị nhiễm Helicobacter pylori được phát hiện ở nhiều chủng tộc.3, 5 Số lượng các “chỉ thị” (marker) được phát hiện trên bộ gene người có liên quan đến đáp ứng với bệnh nhiễm và điều trị ngày càng tăng.

            Một khái niệm ngày càng được quan tâm trong y tế cộng đồng là “Point of Care Testing” (POCT), tạm dịch là “Xét nghiệm tại chỗ”. POCT được định nghĩa là “xét nghiệm được thực hiện ngay tại hoặc rất gần nơi điều trị”. Mục tiêu của POCT là tạo thuận lợi tối đa cho bệnh nhân khi cung cấp kết quả chẩn đoán trong thời gian ngắn nhất để bác sĩ điều trị và nhân viên y tế có thể ra quyết định điều trị và tiến hành các biện pháp chăm sóc phù hợp mà không yêu cầu bệnh nhân phải đến cơ sở y tế nhiều lần. Cho đến nay, POCT bao gồm các xét nghiệm đường huyết, khí và chất điện giải, xét nghiệm đông máu, phát hiện một số chỉ thị tim mạch, thuốc kích thích, xét nghiệm nước tiểu, thử thai, xét nghiệm máu trong phân, chẩn đoán bất thường hemoglobin, thử cholesterol, sàng lọc tác nhân gây bệnh trong thực phẩm và xét nghiệm một số bệnh nhiễm. Sự phát triển của POCT dựa chủ yếu trên các công cụ chẩn đoán nhanh, nhạy với kích thước ngày càng thu nhỏ để tăng tính cơ động.18, 19

           Và bao trùm lên tất cả là những cải tiến và sáng tạo không ngừng nhiều công cụ chẩn đoán mới hiệu quả, rẻ tiền, nhanh. Phương pháp hiện nay còn được xem là khó áp dụng rộng rãi như giải trình tự DNA sẽ dần trở thành phổ biến khi một số nguyên lý mới được ứng dụng để tạo ra những thiết bị giải trình tự thế hệ mới mạnh, nhanh với chi phí hoạt động thấp.12 Giải trình tự kết hợp với PCR “phổ rộng” sẽ giúp phát hiện những tác nhân bệnh mới chưa được xác định. Microarray và “lab-on-a-chip” là kết quả của công nghệ thu nhỏ và tự động hóa, cho phép thao tác trên thể tích mẫu rất nhỏ, nhận kết quả nhanh, tự động hóa và kiểm tra tốt các khâu của quá trình chẩn đoán, giảm chi phí, ... tuy vẫn có một số hạn chế về công nghệ cần được hoàn chỉnh thêm.9 Tự động hóa và sự phát triển của Tin sinh học (Bioinformatics) cũng là những yếu tố cần cho sự xuất hiện những công cụ chẩn đoán mạnh khai thác triệt để các kho dữ liệu sinh học.

            Cuối cùng, các quy định và quy trình về xác nhận tính hiệu quả (validation) của các kit chẩn đoán ngày càng được củng cố và sẽ góp phần quyết định vào việc đưa vào ứng dụng rộng rãi các chẩn đoán phân tử vào công tác chăm sóc sức khỏe.

            Nhìn chung, chẩn đoán phân tử đã thừa hưởng các tiến bộ của nhiều ngành khoa học sinh, hóa, lý, công nghệ thông tin, chế tạo máy, ... để phát triển và bổ sung đắc lực cho chẩn đoán y học truyền thống. Với những dữ liệu về triển vọng tương lai, chẩn đoán phân tử sẽ ngày càng góp phần quan trọng vào cải thiện lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.       Caliendo A.M., Valsamakis A., Zhou Y., Yen-Lieberman B., Andersen J., Young S., Ferreira-Gonzalez A., Tsongalis G.J., Pyles R., Bremer J.W., & Lurain N.S. (2006). Multilaboratory comparison of Hepatitis C Virus viral load assays. J Clin Microbiol., 44:1726-1732.

2.       Dixon  J.S., Boehme R.E. (2000). Lamivudine for the treatment of chronic hepatitis B. Acta Gastroenterol Belg., 63:348-358.

3.       El-Omar E.M., Carrington M., Chow W-H., McColl K.E.L., Bream J.H., Young H.A., Herrera J., Lissowska J., Yuan C-C., Rothman N., Lanyon G., Martin M., Fraumeni J.F., & Rabkin C.S. ((2000). Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer. Nature, 404:398-402.

4.       Fried M.W., Shiffman M.L., Reddy K.R., Smith C., Marinos G., Goncalez F.L., Haussinger D., Diago M., Carosi G., Dhumeaux D., Craxi A., Lin A., Hoffman J. Yu J. (2002). Peginterferon alpha-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N. Engl J Med., 347:975-982.

5.